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細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室的設(shè)置

時(shí)間:2021/8/12 14:54:20

組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作,避免微生物及其他有害因素的影響。目前,超凈工作臺的廣泛使用,很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作,并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
    組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與其他一般實(shí)驗(yàn)室工作的主要區(qū)別在于要求保持無菌操作,避免微生物及其他有害因素的影響。目前,超凈工作臺的廣泛使用,很大程度上方便了組織細(xì)胞培養(yǎng)工作,并使一些常規(guī)實(shí)驗(yàn)室有可能用于進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。 

    細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)能進(jìn)行六方面的工作:無菌操作、孵育、制備、清洗、消毒滅菌處理、儲(chǔ)藏。 

1.無菌操作區(qū) 

(1)無菌操作室:無菌操作區(qū)只限于細(xì)胞培養(yǎng)及其他無菌操作的區(qū)域,好能與外界隔離,不能穿行或受其他干擾。 理想的無菌操作室應(yīng)劃為三部分: 

a) 更衣室—―供更換衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。 

b) 緩沖間—―位于更衣間與操作間之間,目的是為了保證操作間的無菌環(huán)境,同時(shí)可放置恒溫培養(yǎng)箱及某些必需的小型儀器。 

c) 無菌操作間—―專用于無菌操作、細(xì)胞培養(yǎng)。其大小要適當(dāng),且其頂部不宜過高(不超過2.5m)以保證紫外線的有效滅菌效果;墻壁光滑無死角以便清潔和消毒。工作臺安置不應(yīng)靠墻壁,臺面要光滑壓塑作表面,漆成白色或灰色以利于解剖組織及酚紅顯示pH的觀察。 

無菌操作間的空氣消毒: 

    紫外線燈—-產(chǎn)生臭氧,并且室內(nèi)溫度及濕度均較高,不利于工作人員健康。 空氣過濾的恒溫恒濕裝置—-最 好。 

表1 潔凈室(區(qū))空氣潔凈度級別表 

潔凈度級別 塵粒最大允許數(shù)/立方米 微生物最大允許數(shù) 浮游菌/立方米 沉降菌/皿 

100級 3,500 0 5 1 

10000級 350,000 2,000 100 3 

100000級 3,500,000 20,000 500 10 

300000級 10,350,000 60,000 - 15

無臭氧紫外線消毒器 

    電子消毒滅菌器—-在高壓電場作用下,電子管的內(nèi)外電極發(fā)生強(qiáng)烈電子轟擊,使空氣電離而將空氣中的氧轉(zhuǎn)換成臭氧。臭氧是一種強(qiáng)氧化劑,能同細(xì)菌的胞膜及酶蛋白氫硫基進(jìn)行氧化分解反應(yīng),從而靠臭氧氣體彌漫性擴(kuò)散達(dá)到殺菌之目的,消毒時(shí)沒有死角。消毒后空間的殘留臭氧只需30~40min即能自行還原成氧氣,空氣不留異味,消毒物體表面不留殘毒。 

(2)凈化工作臺:操作簡單,安裝方便,占用空間小且凈化效果很好。一般細(xì)菌培養(yǎng)室使用的凈化工作臺主要有兩種:a)側(cè)流式或稱垂直式 b)外流式或稱水平層流式。 

    凈化工作臺工作原理(大致相同)—-通常是將室內(nèi)空氣經(jīng)粗過濾器初濾,由離心風(fēng)機(jī)壓入靜壓箱,再經(jīng)高效空氣過濾器精濾,由此送出的潔凈氣流以一定的均勻的斷面風(fēng)速通過無菌區(qū),從而形成無塵無菌的高潔凈度工作環(huán)境。 


細(xì)胞培養(yǎng)

    側(cè)流式工作臺—-空氣凈化后的氣流由左或右側(cè)通過工作臺面流向?qū)?cè),也有從上向下或從下向上流向?qū)?cè),形成氣流屏障保持工作區(qū)無菌。工作臺結(jié)構(gòu)為封閉式。 

    外流式(水平式)工作臺—-凈化后的空氣面向操作者流動(dòng),因而外方氣流不致混入操作,但進(jìn)行有害物質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作則對操作者不利。工作臺結(jié)構(gòu)為開放式(已少用)。 

凈化工作臺應(yīng)用注意:  

(1)凈化工作臺應(yīng)安裝在隔離好的無菌間或清潔無塵的房間內(nèi),以免塵土過多易使過濾器阻塞,降低凈化效果,縮短其使用壽命。 

(2)新安裝的或長期未使用的工作臺,工作前必須對工作臺和周圍環(huán)境用真空吸塵器或不產(chǎn)生纖維的工具進(jìn)行清潔工作,然后再采用藥物滅菌法或紫外線滅菌進(jìn)行滅菌處理。 

(3)使用凈化工作臺前,應(yīng)先用75%酒精擦洗臺面,并提前以紫外線滅菌燈照射30~50min處理凈化工作區(qū)內(nèi)積存的微生物。關(guān)閉滅菌燈后應(yīng)啟動(dòng)風(fēng)機(jī)使之運(yùn)轉(zhuǎn)兩分鐘后再進(jìn)行培養(yǎng)操作。 

(4)凈化工作區(qū)內(nèi)不應(yīng)存放不必要的物品,以保持潔凈氣流流型不受干擾。 

(5)注意凈化區(qū)內(nèi)氣流的變化,一旦感到氣流變?nèi)酰缇凭珶艋鹧娌粍?dòng),加大電機(jī)電壓仍未見情況改變則說明濾器已被阻塞,應(yīng)及時(shí)更換。一般情況下,高效過濾器三年更換一次。更換高過濾器應(yīng)請專業(yè)人員操作,以保持密封良好。粗過濾器中的過濾布(無紡布)應(yīng)定期清洗更換,時(shí)間應(yīng)根據(jù)工作環(huán)境潔凈程度而定,通常間隔3-6個(gè)月進(jìn)行一次。 

(6)凈化工作臺使用完畢應(yīng)及時(shí)清理工作臺面上的物品并用酒精擦洗臺面使之始終保持潔凈。 

(7)凈化工作臺應(yīng)定期進(jìn)行功能測試,檢查凈化工作臺各項(xiàng)工作指標(biāo)是否達(dá)到要求,例如進(jìn)行無菌試驗(yàn),定期檢查臺面空氣的潔凈度是否達(dá)標(biāo)。 

    超凈工作臺的無菌程度檢查超凈工作臺在消毒處理后,無菌試驗(yàn)前及操作過程中需檢查空氣中菌落數(shù);取直徑約90mm平皿,在超凈工作臺內(nèi)點(diǎn)燃酒精燈,在酒精燈旁,以無菌操作,將平皿半開注入溶化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約20ml,制成平板,在30~35℃預(yù)培養(yǎng)48小時(shí),證明無菌后將平板3個(gè),以無菌方式帶入超凈工作臺內(nèi)左、中、右各放一個(gè);打開平皿蓋扣置,平板在空氣中暴露30分鐘后將平皿蓋蓋好,置30~35℃培養(yǎng)48小時(shí),取出檢查,100級清潔度要求:3個(gè)平皿上生長的菌落數(shù)平均不得超過1個(gè)。 

    超凈工作臺應(yīng)定期請有關(guān)部門檢查其潔凈度,應(yīng)達(dá)到100級(一般用塵埃粒子計(jì)數(shù)儀)檢測塵埃粒徑≤5祄的粒數(shù)不得超過3.5個(gè)/升;空氣流量應(yīng)控制在0.75~1.0m3/s;細(xì)菌菌落數(shù)平均<1個(gè),可根據(jù)無菌狀況必要時(shí)置換過濾器。 2.孵育區(qū) 

    本區(qū)對無菌的要求雖不比無菌區(qū)嚴(yán)格,但仍需清潔無塵,因此也應(yīng)設(shè)置在干擾少而非來往穿行的區(qū)域。孵育可在孵箱或可控制溫度的溫室中進(jìn)行,后者費(fèi)用高,一般實(shí)驗(yàn)室多采用孵箱進(jìn)行工作。 

3.制備區(qū) 

    在該區(qū)主要進(jìn)行培養(yǎng)液及有關(guān)培養(yǎng)用的液體等的制備。 

4.儲(chǔ)藏區(qū) 

    主要存放各類冰箱、干燥箱、液氮罐、無菌培養(yǎng)液、培養(yǎng)瓶等,此環(huán)境也需要清潔無塵。 

5.清洗和消毒滅菌區(qū) 

    清潔和消毒滅菌區(qū)應(yīng)與其他區(qū)域分開,主要進(jìn)行所有細(xì)胞培養(yǎng)器皿的清洗、準(zhǔn)備、消毒及三蒸水制備等工作。 
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